ELISA
Das Verfahren
Der indirekte ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ist ein Antikörper-Suchverfahren, das auf einer enzymatischen Farbreaktion basiert.
Untersucht wird Blutserum des Tieres.
Sind Antikörper (Abwehrstoffe des Immunsystems) gegen die untersuchte Krankheit in der Serumprobe enthalten, färbt sich das Präparat mehr oder weniger stark. Die Farbdichte wird in einem Gerät gemessen und gilt als proportional zur Menge der Antikörper.
Sind Antikörper gegen die untersuchte Krankheit im Blut enthalten, ist eine vorausgegangene Infektion des Tieres anzunehmen.
Nicht zuverlässig ist mit dem ELISA Verfahren allein festzustellen, ob die Infektion noch vorhanden ist oder bereits überwunden wurde.
Man weiß aber, dass bestimmte Infektionen kaum zu heilen sind (wie z. B. Leishmaniose), und man weiß auch, dass Antikörper je nach Erreger noch mehr oder weniger lange im Blut zirkulieren können, auch wenn das Tier wieder gesund (erregerfrei) ist.
Bei Ergebnissen im niedrig positiven Bereich ist an Kreuzreaktionen zu denken (siehe unten). Falsch negative Ergebnisse sind ebenfalls möglich.
Durchführung
Mikrotiterplatte
Die Durchführung erfolgt in sogenannten Mikrotiterplatten. Das sind kleine Kunststofftabletts mit einer Anzahl von Mulden, auch Näpfchen genannt. In jeder Mulde wird das Serum eines anderen Patienten untersucht.
Phase 1
In jeder Mulde auf der Mikrotiterplatte befinden sich Antigene (Teile des betreffenden Erregers), die auf die Gefäßwände aufgebracht sind.
Nun wird etwas Blutserum des Patienten in eine Mulde gegeben. Befinden sich Antikörper gegen den Erreger im Serum, docken diese nun an den Antigenen an der Gefäßwand an.
Überschüssige Antikörper werden anschließend abgespült.
Phase 2
Nun werden "Reporter-Antikörper" hinzugegeben, das sogenannte Konjugat. Diese Antikörper tragen ein bestimmtes Enzym an sich und docken Ihrerseits an den bereits vorhandenen Antigen-Antikörperkomplex an.
Durch Spülen werden anschließend alle Antikörper entfernt, die sich nicht gebunden haben.
Phase 3
Als letzter Schritt wird ein Substrat hinzugegeben, das mit den Enzymen der Reporter-Antikörper reagiert.
Färbt sich nun die Flüssigkeit, dann waren die gesuchten Antikörper im Blut des Tieres vorhanden.
Die Mikrotiterplatte wird nun in den ELISA-Reader geschoben, der die Farbdichte misst. Die Höhe der Farbdichte gilt als proportional zur Menge der vorhandenen Antikörper.
Zuverlässigkeit
Probleme bei der Durchführung
Das ELISA-Verfahren erfordert ähnlich dem IFAT-Verfahren eine Reihe von exakt vorgeschriebenen Arbeitsgängen, die manuell von Laborpersonal durchgeführt werden müssen. Es gibt auch hier eine Reihe von Fehlermöglichkeiten, die zu einem falsch positiven oder falsch negativen Ergebnis führen können.
Die Qualität der Erreger auf der Mikrotiterplatte kann zudem stark variieren, weil es sich um natürliches Material handelt, das speziell für diesen Zweck gezüchtet wird.
Die Beurteilung unter dem Mikroskop fällt zwar weg, weil die Messung der Farbdichte maschinell erfolgt.
Es gibt aber derzeit noch keine zertifizierten Standards für diese Verfahren. So darf sich beispielsweise jede Universitäts-Tierklinik oder ein Veterinärlabor selbst Erreger züchten und in einem eigenen ELISA-Verfahren einsetzen. Einige tun dies auch, andere importieren fertige Mikrotiterplatten aus dem Ausland.
Das Ergebnis solcher Untersuchungen ist deshalb nur unter Vorbehalt zu beurteilen bzw. die Beurteilung bedarf längerer Erfahrung. Aus diesem Grund gibt es auch keine allgemeingültigen Normwerte. Ab welchem Wert ein Ergebnis als positiv betrachtet wird, gibt das Labor individuell im Befund an.
Da das Antigen laufend nachgezüchtet werden muss und deshalb von unterschiedlicher Qualität ist, lassen sich Ergebnisse auch nur dann für Verlaufskontrollen heranziehen, wenn gleichzeitig mit der neuen Probe immer auch die letzte (für den Zweck tiefgekühlte) Probe erneut untersucht wird.
Die Höhe des ELISA-Resultats stellt kein Maß für die Schwere der Erkrankung dar. Schwankungen der Antikörperkonzentration bei Verlaufskontrollen sind nicht immer ein Beweis dafür, dass sich an der Schwere der Infektion etwas verändert hätte!
Sie sind abhängig von den oben genannten Fakten und auch davon, wie sehr sich das Immunsystem des Tieres gerade mit der Krankheit auseinandersetzen kann - viele Faktoren wie z. B. der Allgemeinzustand, Stress, weitere Krankheiten und auch Impfungen spielen dabei eine große Rolle.
Probleme durch verschiedene Erregerstämme
Von den Infektionskrankheiten, mit denen wir uns hier beschäftigen, gibt es zumeist nicht nur einen einzigen Erregerstamm, sondern regional verschiedene, oft auch mehrere gleichzeitig. Diese können je nach ihrer Art so unterschiedlich sein, dass ein ELISA, der z. B. einen italienischen Erregerstamm verwendet, möglicherweise Antikörper gegen spanische Stämme nicht zuverlässig nachweisen kann.
Die Leishmaniose-Diagnostik ist hiervon stark betroffen, neben anderen Infektionskrankheiten.
Probleme durch Kreuzreaktionen
Das ELISA-Verfahren reagiert nicht immer nur auf Antikörper gegen den gesuchten Erreger, sondern teilweise auch auf Antikörper gegen bestimmte andere Krankheiten.
Der Leishmaniose-ELISA zeigt zum Beispiel Kreuzreaktionen gegen Babesiose - möglicherweise weil die Leishmaniose-Antikörper ähnlich denen der Babesiose strukturiert sind.
Das bedeutet, dass ein Hund einen positiven Leishmaniose-Befund haben kann, obwohl er nicht mit Leishmaniose, sondern mit Babesiose infiziert ist.
Durch Kreuzreaktionen verursachte positive Resultate liegen allerdings durchweg im niedrigen Bereich. Näheres dazu lesen Sie in der Beschreibung der einzelnen Krankheiten.
Warum wird der ELISA überhaupt verwendet, wenn er offensichtlich nicht immer zuverlässig zu beurteilen ist?
Weil es noch kein absolut sicheres Einzel-Nachweisverfahren gibt.
Das ELISA-Ergebnis soll deshalb immer im Zusammenhang mit weiteren Laboruntersuchungen (siehe nebenstehendes Menü), der Herkunft des Hundes und der Symptomatik betrachtet werden. Nur so lässt sich eine möglichst sichere Diagnose finden.
Eine Ausnahme sind sehr hohe Resultate. Ab einer bestimmten Höhe sind Kreuzreaktionen unwahrscheinlich, und auch die möglichen Fehler haben dann nicht mehr so großen Einfluss.
Näheres zur weiteren Diagnostik erfahren Sie bei der Beschreibung der jeweiligen Krankheiten.
Copyright Christiane Maasjost für Leishmaniose-Forum e.V.